Sólo quince años después de la fundación de la ciudad de Lima, el Cabildo gestionó ante la Corona la creación de una universidad. En respuesta, el emperador Carlos V y su madre, la reina doña Juana, expidieron la Cédula Real que creaba la primera universidad del Nuevo Mundo, dándole igual rango que a la famosa de Salamanca. La universidad comenzó a funcionar dos años más tarde y su historia está estrechamente unida a la historia del país. El virrey Toledo, que gobernó entre 1569 y 1581, estableció las cátedras de Teología, Leyes, Filosofía, Medicina y Gramática. Además, creó la cátedra de Lengua Quechua que se mantuvo durante dos siglos, hasta que fue abolida por los reyes.
San Marcos sólo estaba al alcance de los criollos de familias ricas, porque estudiar y especialmente recibirse, resultaba terriblemente caro. A partir de 1743 estas condiciones comenzaron a mejorar en cierta medida. En las aulas de San Marcos surgieron las corrientes ideológicas que llevaron a la Independencia, y tanto San Martín como Bolívar dictaron numerosas medidas en apoyo de la universidad.